基于先進(jìn)技術(shù)的優(yōu)化策略對(duì)于最大化產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。
貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至少在小規(guī)模上被廣泛用于生產(chǎn)許多下一代療法，包括用于基因和基因修飾細(xì)胞療法的病毒載體以及非基因修飾的細(xì)胞療法。隨著對(duì)這些先進(jìn)藥物的需求迅速增加，需要克服貼壁生產(chǎn)過(guò)程的橫向擴(kuò)展和放大的挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞收獲步驟 - 無(wú)論細(xì)胞是被丟棄還是作為產(chǎn)品收集。
許多不同的貼壁方法和產(chǎn)品類型
FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 的項(xiàng)目設(shè)計(jì)和全球分析策略組的項(xiàng)目設(shè)計(jì)總監(jiān) Ian Goodwin 表示，用于生產(chǎn)生物制藥產(chǎn)品的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)可以通過(guò)多種方式用于許多不同類型的生物制品。單克隆抗體 (mAb)、重組蛋白和大多數(shù)病毒載體在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)，通常不需要收集細(xì)胞。對(duì)于分泌到培養(yǎng)基中的產(chǎn)物，收集上清液并丟棄細(xì)胞。如果產(chǎn)物不被分泌或既被內(nèi)化又被分泌，則必須首先裂解細(xì)胞、以釋放產(chǎn)物，然后收集裂解物。在這兩種情況下，收集的生物工藝流體都經(jīng)過(guò)過(guò)濾，通常是深層過(guò)濾，然后是除菌過(guò)濾。
顧名思義，貼壁細(xì)胞需要它們可以附著的基質(zhì)或支架。在小規(guī)模條件下，平面系統(tǒng)提供了相關(guān)的表面。在更大規(guī)模上，固定床生物反應(yīng)器提供了支持。如果傾向于懸浮樣條件，可以使用微載體或由各種合成材料組成的基球作為細(xì)胞結(jié)合的表面。
兩種主要的收獲方法
無(wú)論用于支持貼壁細(xì)胞的方法和工藝的規(guī)模如何，細(xì)胞都必須與其支持物分離。Univercells Technologies 產(chǎn)品經(jīng)理 Clément Dumont 表示，通用原則適用于不同應(yīng)用的所有細(xì)胞分離操作。“無(wú)論細(xì)胞是用于生產(chǎn)生物制品還是直接用作最終產(chǎn)品，分離過(guò)程都將涉及將細(xì)胞暴露于酶促和潛在的機(jī)械作用。該過(guò)程的特殊性將取決于不同的考慮因素，主要是細(xì)胞的類型、它們的預(yù)期用途以及操作執(zhí)行的規(guī)模，”他解釋道。
例如，用于小規(guī)模研發(fā)實(shí)驗(yàn)的 T 瓶中的人胚腎 293 (HEK293) 細(xì)胞培養(yǎng)通常可以通過(guò)遵循一系列簡(jiǎn)單的操作來(lái)分離：移除培養(yǎng)基，添加分離酶并孵育，然后收集細(xì)胞，Dumont 說(shuō)。典型的酶包括胰蛋白酶或 Accutase (Invitrogen)。在傳代步驟中，通常通過(guò)手動(dòng)搖動(dòng)燒瓶（機(jī)械作用）來(lái)輔助細(xì)胞收集。
對(duì)于大多數(shù)大規(guī)模、基于多層培養(yǎng)器皿的工藝，通常采用酶促收獲。Samsung Biologics 制造、科學(xué)和技術(shù)上游工藝團(tuán)隊(duì)的首席科學(xué)家 Lee Seung-sun 指出，由于物理方法不適用，因此這種方法還用于從微載體和固定床生物反應(yīng)器中去除貼壁細(xì)胞。“在收集用作細(xì)胞療法的細(xì)胞時(shí)必須特別小心，以避免損壞細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)，即使在使用酶促工藝時(shí)也是如此，因?yàn)槟承┟笗?huì)降解這些重要的細(xì)胞特征，”他補(bǔ)充道。
然而，當(dāng)放大規(guī)模時(shí)，必須復(fù)制與研發(fā)規(guī)模相同的行動(dòng)，但表面積要大得多。Dumont表示，這會(huì)增加復(fù)雜性。“例如，從 40 層細(xì)胞工廠 (CF40) 中分離細(xì)胞可能需要專門的設(shè)備來(lái)處理流體和容器或施加機(jī)械作用。當(dāng)涉及大量容器時(shí)，這些特殊要求可能變得不切實(shí)際，”他爭(zhēng)辯道。
微載體呈現(xiàn)出不同的情況。“細(xì)胞和微載體可能經(jīng)過(guò)化學(xué)處理，如果微載體不溶，混合物會(huì)通過(guò)篩網(wǎng)分離細(xì)胞。如果微載體可以用果膠酶溶解，用這種酶處理可以釋放細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步工藝處理，”FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 病毒基因治療工藝開發(fā)高級(jí)總監(jiān) Michael Baker 觀察到。
根據(jù) Goodwin 的說(shuō)法，在某些情況下，細(xì)胞療法在類似貼壁的條件下生長(zhǎng)，但細(xì)胞附著有些松散，從而無(wú)需使用解離試劑。他還強(qiáng)調(diào)，隨著項(xiàng)目從臨床前階段進(jìn)入商業(yè)階段或規(guī)模，關(guān)鍵工藝參數(shù)和細(xì)胞收獲的設(shè)計(jì)空間可能會(huì)發(fā)生變化；即便如此，Goodwin 建議盡可能避免對(duì)收獲方法進(jìn)行任何更改。
規(guī)模擴(kuò)展的挑戰(zhàn)
需要貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞類型在規(guī)模放大和收獲方面遇到挑戰(zhàn)，而這些可能不會(huì)影響懸浮培養(yǎng)。鑒于可以在平面器皿中進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的最大規(guī)模是有限的，因此需要橫向規(guī)模擴(kuò)展而不是放大來(lái)生產(chǎn)更大的產(chǎn)品數(shù)量，特別是對(duì)于表達(dá)型產(chǎn)品。Baker 評(píng)論道：“橫向擴(kuò)展的流程需要更多的勞動(dòng)密集型工作，需要更多的空間、時(shí)間和人員，可能會(huì)危及產(chǎn)品質(zhì)量。”
事實(shí)上，在扁平器皿中運(yùn)行的細(xì)胞培養(yǎng)工藝無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化并且涉及大量手動(dòng)操作，這也意味著制造商需要經(jīng)驗(yàn)豐富且技術(shù)嫻熟的細(xì)胞科學(xué)家，他們可以幫助減少?gòu)?fù)雜收獲工藝實(shí)施過(guò)程中出錯(cuò)的可能性，Seung-sun稱。
“目前，高效的培養(yǎng)容器無(wú)法用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)和收獲。雖然可以使用多層培養(yǎng)工廠，但它們存在一些限制，例如細(xì)胞增殖的最小表面積。由于缺乏高效的培養(yǎng)容器，收集此類細(xì)胞仍然需要 CO2 培養(yǎng)箱和人工操作的幫助，”Seung-sun 補(bǔ)充道。
Seung-sun 繼續(xù)指出，值得注意的是，當(dāng)前制造的大多數(shù)細(xì)胞治療產(chǎn)品（即嵌合抗原受體 T 細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞）都是自體的、針對(duì)患者的療法，可以小規(guī)模生產(chǎn)。此外，Baker 指出，使用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的許多治療方法都針對(duì)極罕見的適應(yīng)癥，在這些適應(yīng)癥中，商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)不需要顯著擴(kuò)大規(guī)模，因此，2D培養(yǎng)方式可能是生產(chǎn)藥物底物的可行方式。
同樣，典型細(xì)胞治療應(yīng)用所需的細(xì)胞數(shù)量低于生產(chǎn)其它生物藥所需的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù) Goodwin 的說(shuō)法，對(duì)于這些產(chǎn)品，挑戰(zhàn)就變成了需要在封閉的一次性系統(tǒng)中生產(chǎn)它們，以最大限度地減少生產(chǎn)過(guò)程的無(wú)菌性挑戰(zhàn)并降低污染風(fēng)險(xiǎn)。
規(guī)模放大的阻礙
雖然自體細(xì)胞療法在當(dāng)今市場(chǎng)占據(jù)主導(dǎo)地位，但許多候選藥物都是同種異體或供體來(lái)源的。因此，Seung-sun 認(rèn)為，有效擴(kuò)大貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝的能力對(duì)于未來(lái)細(xì)胞療法的商業(yè)化至關(guān)重要。
對(duì)于確實(shí)需要規(guī)模放大的工藝，Baker指出，固定床生物反應(yīng)器試圖通過(guò)使用有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的復(fù)雜纖維基質(zhì)或支架將表面積集中到一個(gè)單元中來(lái)克服放大問(wèn)題。同時(shí)，微載體可以使用攪拌罐反應(yīng)器和類似懸浮培養(yǎng)的條件。“這些屬性使 3D 反應(yīng)器和微載體成為貼壁細(xì)胞系產(chǎn)品的良好選擇，這些產(chǎn)品旨在治療更大的患者群體和/或需要更大體積的細(xì)胞，”他總結(jié)道。
然而，規(guī)模放大并非沒有問(wèn)題。表達(dá)在貼壁細(xì)胞內(nèi)部的產(chǎn)物需要細(xì)胞收集。Baker 表示，在孔板和培養(yǎng)皿等非常小規(guī)模的環(huán)境中，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械操作（刮擦）并以非常高的效率進(jìn)行收集。
較大的固定床生物反應(yīng)器也必須接種細(xì)胞。對(duì)于種子擴(kuò)增鏈操作，Dumont 強(qiáng)調(diào)，生成足夠的細(xì)胞數(shù)量所需的扁平器皿單元數(shù)量不斷增加，這造成了操作限制。“需要大型設(shè)備和相關(guān)勞動(dòng)力來(lái)操縱大量裝置，導(dǎo)致大量 CAPEX [資本支出] 和 OPEX [運(yùn)營(yíng)費(fèi)用]，同時(shí)還需要更多手動(dòng)（非自動(dòng)）操作，這會(huì)增加污染風(fēng)險(xiǎn)和低再現(xiàn)性，“ 他說(shuō)。大收獲體積也可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。“在下一步之前可能需要進(jìn)一步處理和濃縮細(xì)胞，這對(duì)于種子培養(yǎng)操作來(lái)說(shuō)尤其成問(wèn)題，因?yàn)樵谡麄€(gè)過(guò)程中需要多次傳代，”Dumont 評(píng)論道。
Dumont 表示，與此同時(shí)，使用微載體的工藝可能難以轉(zhuǎn)移，而且往往需要更多優(yōu)化才能在大規(guī)模條件下實(shí)現(xiàn)合適的工藝。“剪切應(yīng)力和基球聚集是需要解決的常見缺點(diǎn)。這些生物反應(yīng)器的體積很大，導(dǎo)致占地面積也很大，”他說(shuō)。
此外，Baker 觀察到，化學(xué)釋放劑必須從最終產(chǎn)品基質(zhì)中去除，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為是與工藝相關(guān)的雜質(zhì)。他還指出，當(dāng)使用微載體在懸浮體系中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，還應(yīng)考慮溶解微載體或提取微載體的溶出 & 析出問(wèn)題。
最后，Seung-sun 指出，目前的固定床生物反應(yīng)器較難對(duì)細(xì)胞進(jìn)行取樣并獲得有關(guān)細(xì)胞狀況、代謝變化或活細(xì)胞數(shù)量的直接分析數(shù)據(jù)。“充其量，可以根據(jù)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度來(lái)估計(jì)活細(xì)胞的數(shù)量，”他解釋道。
一些優(yōu)化策略
貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝的幾乎所有方面都可以通過(guò)某種方式進(jìn)行優(yōu)化。首先，根據(jù) Dumont 的說(shuō)法，可以優(yōu)化分離過(guò)程，以考慮具有不同屬性和行為特征的不同類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞在脆弱性/抗降解、聚集等方面具有不同的特性和行為特征。這種優(yōu)化將導(dǎo)致對(duì)酶、孵育時(shí)間和機(jī)械作用水平的不同選擇。“選擇用于將該工藝過(guò)程工業(yè)化的技術(shù)至關(guān)重要。需要在快速且簡(jiǎn)單的操作與適應(yīng)各種工藝類型的靈活性之間找到良好的平衡，”他說(shuō)。
Seung-sun 觀察到，優(yōu)化用于細(xì)胞分離的酶處理工藝的條件也是一個(gè)重要的策略。“研究濃度、時(shí)間和溫度，以及最大化培養(yǎng)容器與酶的接觸面積，有助于最大限度地減少細(xì)胞損傷并提高收獲收率，”他說(shuō)。Goodwin 補(bǔ)充說(shuō)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有利于優(yōu)化細(xì)胞裂解和去除裂解試劑（通過(guò)各種純化步驟）。
對(duì)于作為治療產(chǎn)品的細(xì)胞，除了使用封閉環(huán)境來(lái)確保無(wú)菌性和降低污染風(fēng)險(xiǎn)之外，Goodwin 觀察到任何破壞細(xì)胞附著的過(guò)程都必須針對(duì)細(xì)胞的釋放進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)最大限度地減少結(jié)構(gòu)完整性受損的細(xì)胞，這可能會(huì)影響細(xì)胞治療產(chǎn)品的功效、效力和/或安全性。
技術(shù)發(fā)展的幫助
生物制藥行業(yè)雖然保守，但在創(chuàng)新方面有其基礎(chǔ)。細(xì)胞收獲操作受益于不斷提高性能和降低生物藥生產(chǎn)成本的行業(yè)趨勢(shì)。Baker 表示，新的化學(xué)解離試劑和物理分離方法不斷被開發(fā)和推出，以幫助研究人員改進(jìn)細(xì)胞收獲程序。他補(bǔ)充說(shuō)，最近還引入了平皿自動(dòng)化程序，可以將細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞收獲步驟的勞動(dòng)密集型程序減少 30-50%。
Seung-sun 重點(diǎn)介紹了新的培養(yǎng)設(shè)備，例如 Wilson Wolf 的 G-Rex、Terumo 的 Quantum、Lonza 的 Cocoon 和 Miltenyi Biotech 的 CliniMACS 系統(tǒng)，但他確實(shí)指出，大多數(shù)這些“cell-therapy-in-a-box”解決方案都設(shè)計(jì)用于支持懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。與此同時(shí)，Univercells Technologies 專注于通過(guò)能夠?qū)崿F(xiàn)工藝強(qiáng)化和鏈接化的技術(shù)，來(lái)改進(jìn)病毒載體的生產(chǎn)。
Dumont 指出，該公司最近的工作是開發(fā)了一種有效的解決方案，用于從其臺(tái)式規(guī)模的 scale-X 固定床生物反應(yīng)器中收獲細(xì)胞，以支持優(yōu)化的種子培養(yǎng)。“臺(tái)式 scale-X 細(xì)胞收獲模塊允許在固定床生物反應(yīng)器中強(qiáng)化細(xì)胞生長(zhǎng)，顯著提高工藝強(qiáng)化，減少占地面積和所需的操作，”他說(shuō)。Dumont 表示，機(jī)械作用可提供高細(xì)胞收獲率（高達(dá) 2.1x10^9 cells/m2）和出色的活性 (>90%)。“自動(dòng)控制系統(tǒng)支持可配置的收獲方案，預(yù)消毒的封閉系統(tǒng)降低了與平皿系統(tǒng)相關(guān)的可重復(fù)性和無(wú)菌風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，同時(shí)還降低了材料和人工成本，”他補(bǔ)充道。
未來(lái)的希望是實(shí)現(xiàn)封閉、自動(dòng)化工藝
最后，Dumont 強(qiáng)調(diào)，成功的細(xì)胞收獲取決于特定的工藝和為該工藝的工業(yè)化而選擇的技術(shù)。“生產(chǎn)平臺(tái)需要支持快速和簡(jiǎn)單的操作，同時(shí)提供適應(yīng)各種工藝類型的靈活性，”他說(shuō)。
預(yù)計(jì)技術(shù)將繼續(xù)進(jìn)步。Goodwin 指出了改進(jìn)的細(xì)胞收獲解決方案，可以最大限度地提高細(xì)胞回收率，尤其是在封閉系統(tǒng)中。“要么細(xì)胞收獲程序?qū)⒗^續(xù)發(fā)展、以支持大規(guī)模工藝，要么培養(yǎng)容器將專門針對(duì)細(xì)胞收獲目的而進(jìn)行設(shè)計(jì)，”他評(píng)論道。
Goodwin 表示，向封閉系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變將繼續(xù)，自動(dòng)化控制的采用也將增加 - 這既是為了減少操作員錯(cuò)誤和污染的風(fēng)險(xiǎn)，也是為了最大限度地減少生產(chǎn)批次之間的操作差異。他說(shuō)，這些進(jìn)步也將有助于降低生產(chǎn)成本。
另外，Seung-sun 預(yù)計(jì)細(xì)胞治療市場(chǎng)將逐漸轉(zhuǎn)向懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。“與懸浮培養(yǎng)相比，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)效率低得多。工業(yè)生物藥生產(chǎn)方面取得的進(jìn)展為下一代治療產(chǎn)品的類似改進(jìn)提供了動(dòng)力，”他說(shuō)。一項(xiàng)可能促進(jìn)這種轉(zhuǎn)變的技術(shù)是一次性 3D 垂直輪生物反應(yīng)器，Goodwin 指出，該技術(shù)已被證明可成功用于將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化為懸浮生長(zhǎng)模式，使用或不使用微載體。
Dumont 表示同意，擺脫橫向規(guī)模擴(kuò)展的手動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)和收獲將從根本上改變此類操作的范式。“為細(xì)胞培養(yǎng)和收獲選擇一個(gè)封閉、自動(dòng)化的解決方案可以降低操作風(fēng)險(xiǎn)并顯著降低成本。最終，這將提高行業(yè)的質(zhì)量和成本效益，”他總結(jié)道。
總的來(lái)說(shuō)，Baker堅(jiān)持認(rèn)為應(yīng)該強(qiáng)調(diào)前瞻性、可擴(kuò)展的選擇。“對(duì)于生物制藥和細(xì)胞治療應(yīng)用，貼壁或貼壁樣培養(yǎng)應(yīng)使用減少無(wú)菌邊界的技術(shù)，并結(jié)合最新的生產(chǎn)污染控制策略。緊跟行業(yè)趨勢(shì)和技術(shù)發(fā)展將帶來(lái)更多的生產(chǎn)批次成功（更少的損失），通過(guò)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)更高效的運(yùn)營(yíng)，并減少對(duì)產(chǎn)品完整性的安全擔(dān)憂，”他總結(jié)道。
原文：Challener, C. Overcoming Harvesting Challenges for Adherent Cell-Culture Processes. BioPharm International 2023 36 (5).
