大規模 AAV 生產
大規模生產和商業化生產需要特定的細胞系特性，例如可放大性和高產量。細胞需要在低成本、無血清的培養基中生長，系統應該符合純度和安全的監管要求。傳統上，基于懸浮的生產是在體積高達 50,000 L 的可重復使用不銹鋼生物反應器 (STR) 或 15 mL - 2,000 L 規模的一次性 STR 中進行的。STR 非常靈活，可提供廣泛的潛在操作條件以及基于充分理解的混合原理的高效氣體傳輸。
搖擺式生物反應器也可用于規模高達 500 L 的懸浮培養。與 STR 不同，這些系統的可放大性有限，因為它們僅使用頂空通氣，但系統易于操作。例如，可實現的體積可用于中等規模的生產，作為大規模細胞生產的種子擴增系列的一部分，以及用于生產（輔助）病毒種子儲備。這種懸浮培養中的細胞基質在數千升的批次生產中顯示出遺傳穩定性。
STR 中達到的細胞密度取決于細胞類型和培養基，但對于沒有細胞截留的批次培養，通常范圍在 5 - 20 × 10^6 cells/mL 之間。適用于 STR 和搖擺系統的灌流模式培養技術可以通過將細胞維持在最佳代謝狀態來增加細胞密度。例如，通過在線生物量測量和灌流速率控制，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞的密度已達到 100 × 10^6 cells/mL。為了保持活性生物量，生物反應器必須配備截留裝置，使其能夠以灌流模式運行培養。
如此高的細胞密度有助于在產品生產開始之前縮短細胞擴增軌跡。以更快的速度達到這些密度可以減少 GMP 生產設施內用于細胞擴增所需的時間和材料。此外，在基于病毒感染的生產系統中支持高細胞密度的能力為基于感染時細胞密度增加的工藝優化和強化創造了機會。如果工藝工程師能夠保持細胞特異性生產率，那么感染時這種更高的密度將提供更高的單位體積生產率。
昆蟲細胞和懸浮馴化的 HEK293 細胞等懸浮細胞系可以在搖擺式反應器和攪拌罐反應器中使用無血清、化學成分確定的培養基生長，使其適用于 AAV 的大規模生產和商業化生產。Merten 對不同上游 AAV 生產系統的輸出進行了全面的、基于文獻的比較，并得出結論，血清型和載體結構的差異阻礙了真正的比較 - 但原則上，不同的生產系統都可以實現 5 × 10^13 至 2.4 × 10^14 vg/L。然而，使用基于 HEK293 轉染的工藝需要大量昂貴（高質量、符合 GMP 標準）的質粒和轉染試劑。
在 2019 年的一份成本比較報告中，Cameau 等人顯示每克質粒 DNA 的成本為100,000 美元（定價基于 GMP 級質粒的大批量訂單）。在他們的模型中，作者假設在 HEK293 懸浮培養中轉染 10^6 cells以生產 AAV，需要 1.5 μg 質粒 DNA，在 10^6 cells/mL 的轉染密度下，每生產 2,000 L，質粒 DNA 需要投資 300,000 美元。用于病毒載體生產的、廣泛使用的基于 HEK293 的瞬時轉染工藝很容易在實驗室規模上執行，但其具有挑戰性的過程控制和可變性可能會在放大過程中造成困難。
BEVS 生產系統已經使用了幾十年，從傳統的研究工具發展成為獸藥產品的生產系統，然后是用于生產人類治療藥物的生產技術。使用該系統的昆蟲細胞生產了多種供人類使用的許可疫苗和療法。其中包括 uniQure 的 Glybera 療法，它在 2012 年成為第一個獲得上市許可的基因療法，以及 2021 年的 COVID-19 疫苗。這樣的記錄證明，如果桿狀病毒在多個傳代中針對遺傳穩定性進行了優化，那么真正的BEVS 生產系統可以實現規模化生產。
例如，源于 S. frugiperda 的細胞系 - Protein Sciences Corporation 的 expressSF+ 細胞系 - 已被用于 Flublok 生產過程中的快速高效放大。有了它，公司在 2-L、10-L、100-L、650-L 和 2,500-L 規模上實現了相同的工藝性能，然后進一步擴大到 21,000-L 生產工藝。BEVS 使用標準化和完全表征的桿狀病毒種子庫來實現一致的上游生產。與 HEK293 轉染工藝相比，Sf9 細胞的感染不需要仔細的混合控制。在生產過程中，攜帶產生重組 AAV 載體所需基因的桿狀病毒被添加到生產生物反應器中以感染 Sf9 細胞培養。該方法最大限度地減少了對培養系統的負面影響（來自治療性轉基因的表達），因為 AAV 載體中通常使用的哺乳動物啟動子在昆蟲細胞中很少或沒有表達。
與 AAV 生產相關的挑戰包括生產過程的穩健性低、AAV 滴度的高可變性以及含基因組顆粒的百分比低/可變。上游工藝的一致性對于使下游生產工藝能夠提供正確且一致的產品質量和產量至關重要。AAV 的大規模生產必須去除無法有效放大的下游技術：例如，離心和梯度超速離心。過濾和層析技術是優選。
AAV 生產下游工藝的一個關鍵挑戰是解決和控制空衣殼和完整衣殼的混合物，空衣殼被認為是工藝相關雜質。為此，重要的是在上游產生盡可能高的完整/空衣殼比，從而簡化隨后使用離子交換層析 (IEX) 在下游工藝中去除空衣殼的過程。它根據顆粒凈表面電荷的相應差異來分離顆粒，對于 AAV，凈表面電荷根據其等電點 (pI) 和環境 pH 值可以是正、中或負的。可以使用多種層析載體，包括膜層析（例如 Pall 的 Mustang S 型）、固定整體柱形式的對流相互作用介質（來自 Sartorius BIA Separations 的 CIM）或基于顆粒的吸附層析（Cytiva 的 Sepharose 填料和 Thermo Fisher Scientific 的 POROS介質）。
許多 AAV 血清型的 pI 已經確定，完整 AAV 衣殼的 pI 略低于空衣殼，因為衣殼結構中的 DNA 帶負電荷。盡管 pI 值差異很小，但 IEX 可以通過優化的洗脫條件將它們分離。基于 IEX 的工藝是可重復的，可以自動化并適應滿足工業生產需求的大規模操作。然而，通常需要對 IEX 方法進行實質性開發，因為分離空顆粒和完整顆粒的條件取決于它們在衣殼和包殼病毒基因組之間的物理化學相互作用。
AAV 生產的監管注意事項
基因治療開發人員非常感興趣的是加速批準途徑。美國食品和藥物管理局 (FDA) 的加速批準范例可以近似為四年時間框架，而不是產品批準的典型 10-11 年 - 如果許可申請的化學、制造和控制 (CMC) 部分足夠穩健，并且如果精心設計的早期臨床研究已證明其有效性。對于希望利用這種范例的公司，必須投資于商業就緒生產平臺的早期開發，這些平臺使用可以迅速擴大到商業生產的工藝，盡快為 CMC 文件包生成可靠的數據。
盡管 BEVS 平臺需要在時間和資源上進行前期投資，來生產和表征高質量的桿狀病毒種子庫，但可通過快速和線性的放大軌跡來平衡這一點，并在工藝和其生物起始材料方面保持一致。在臨床開發或大規模 GMP 生產期間對基于 BEVS 的生物生產工藝進行重大變更是一種潛在的策略，可能會帶來重大的技術和監管挑戰并延遲項目。從一個高效、穩健和可放大的生產平臺開始，開發具有成本效益的生產工藝對于滿足未來的治療需求將變得越來越重要。
商品成本是關鍵
據估計，到 2025 年全球基因治療市場價值將超過 100 億美元。這種增長提供的機會導致開發用于臨床應用的 AAV 載體的公司數量顯著增加，正在進行的 AAV 臨床試驗超過 250 項。對臨床前和臨床病毒載體生產能力的需求正在增加，以支持越來越多的基因治療開發項目。下一代 AAV 生產系統將需要生產足夠數量的治療載體。每個生物生產商都應謹慎選擇能夠滿足其自身臨床和商業需求的生產系統。
基于轉染的生產平臺將為相對低劑量的孤兒病適應癥提供足夠的產量（例如，Luxturna 治療眼病）。然而，隨著基因治療領域轉變為一個為更多患者群體服務的行業，其載體需要系統給藥，以應對越來越多的疾病適應癥，生產能力估計需要增加一到兩個數量級。
一旦 BEVS 在分子和工藝水平上得到適當設計，昆蟲細胞系統就具有明顯的潛力，可以提供具有有利商品成本 (CoG) 的先進 AAV 生產系統。這將有助于該行業解決對病毒載體不斷增長的需求。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
