腺相關(guān)病毒：簡(jiǎn)史
腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus, AAV) 是一種無(wú)囊膜的T=1二十面體病毒，屬于細(xì)小病毒科依賴(lài)病毒屬。所有細(xì)小病毒都具有線性單鏈DNA基因組，兩側(cè)是作為DNA合成起點(diǎn)的反向末端重復(fù)序列 (ITR)。AAV基因組編碼兩個(gè)主要的基因“盒”，由三個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控：p5和p19調(diào)控編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的rep基因的表達(dá)，p40調(diào)控編碼結(jié)構(gòu)病毒顆粒蛋白 (VP1、VP2和VP3) 的cap基因的表達(dá)。rep和cap轉(zhuǎn)錄本都利用一個(gè)共同的多聚腺苷化信號(hào)。其它基因產(chǎn)物也被描述為由其它開(kāi)放閱讀框編碼，例如裝配激活蛋白 (AAP)。獨(dú)特的是，AAV需要與“輔助”病毒 (如腺病毒(AdV) 或單純皰疹病毒(HSV)) 共同感染才能生產(chǎn)性感染。
AAV最早是在20世紀(jì)60年代通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)的，是腺病毒制劑中的污染物。隨后的研究表明，與AAV血清學(xué)相關(guān)的病毒在人類(lèi)中廣泛傳播。在沒(méi)有輔助病毒的情況下的感染還沒(méi)有記錄，同時(shí)感染 (如AAV和Ad) 引起的疾病并不比單獨(dú)感染Ad更嚴(yán)重，因此AAV被認(rèn)為是非致病性的。
由于AAV在病原學(xué)上不被認(rèn)為是病原體，因此AAV的研究活動(dòng)最初僅限于少數(shù)實(shí)驗(yàn)室。AAV遺傳的流線型特性，以緊湊、最小的病毒基因組為特征，促進(jìn)了分子遺傳分析，并為研究細(xì)胞途徑和病毒-細(xì)胞相互作用提供了一個(gè)多功能平臺(tái)。Muzyczka實(shí)驗(yàn)室的突破性研究表明，病毒基因可以被非病毒基因取代，例如報(bào)告基因或僅保留非編碼ITR序列的治療基因。這些初步報(bào)告表明，這種重組AAV結(jié)構(gòu)可以作為基因遞送載體，能夠“轉(zhuǎn)導(dǎo)”分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞 (即轉(zhuǎn)基因基因表達(dá))。這些發(fā)現(xiàn)激發(fā)了人們對(duì)AAV基因治療應(yīng)用的興趣。
將病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中并不是細(xì)小病毒復(fù)制的必然步驟，這對(duì)于一些已適合用作基因載體的其它病毒組而言是必需的，即逆轉(zhuǎn)錄病毒（逆轉(zhuǎn)錄病毒科）。然而，野生型 (wt) 或重組 AAV 的病毒顆粒 DNA 可能通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)程進(jìn)行整合：wtAAV 有整合到 AAVS1 中的傾向，AAVS1 是人類(lèi) 19 號(hào)染色體上的一個(gè)確定位點(diǎn)，而缺乏rep基因產(chǎn)物的重組AAV的整合是隨機(jī)發(fā)生的，并且在基因組位置方面既罕見(jiàn)又相對(duì)不加區(qū)別。然而，有報(bào)道稱(chēng)病毒載體整合位點(diǎn)偏向載體和染色體 DNA 之間的（微觀）同源區(qū)域，并且 AAV ITR 和 AAVS1 的序列相似性可能導(dǎo)致整合出現(xiàn)偏差。
AAV-5 的發(fā)現(xiàn)、分離和流行病學(xué)
目前，三種天然存在的 AAV 正在開(kāi)發(fā)用于大多數(shù)基因治療應(yīng)用：AAV-2、AAV-5 和 AAV-9。分配給這些 AAV 分離株的數(shù)字名稱(chēng)有歷史依據(jù)：繼 1965 年首次發(fā)現(xiàn) AAV 之后，從細(xì)胞培養(yǎng)制劑、組織樣本和圈養(yǎng)獼猴中獲得了具有不同抗原特性的其它 AAV 分離株。為了區(qū)分這些抗原性不同的 AAV，建立了基于血清學(xué)的命名系統(tǒng)。該系統(tǒng)根據(jù) AAV 的分離順序?yàn)樗鼈兎峙鋽?shù)字名稱(chēng)，稱(chēng)為“血清型”（迄今為止，至少已識(shí)別出 12 種自然存在的血清型）。然而，此后已確定 AAV-5 實(shí)際上代表一種獨(dú)立的病毒物種，名為“哺乳動(dòng)物依賴(lài)細(xì)小病毒 1”。另一方面，所有其它 AAV 分離株都是另一種 AAV 物種“靈長(zhǎng)類(lèi)依賴(lài)細(xì)小病毒 1”的變種。
AAV-5 是由 Ursula Bantel-Schaal 博士和 Harald zur Hausen 博士于 1984 年在德國(guó)海德堡的德國(guó)癌癥研究中心（Deutsches Krebsforschungszentrum 或 DKFZ）發(fā)現(xiàn)的。該病毒是從生殖器軟骨瘤標(biāo)本中臨床分離出來(lái)的，并顯示在腺病毒共感染的情況下可以感染培養(yǎng)中的人類(lèi)細(xì)胞。將一份受感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液提供給美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 (NIH)，Kotin 實(shí)驗(yàn)室成員對(duì)病毒基因組進(jìn)行分子克隆和測(cè)序。 Chiorini 等人證明重組 rAAV-5 載體具有生物活性，因此可將 AAV-2 載體基因組“反殼化”到細(xì)胞中。由于每種病毒之間的基因組差異，特別是 (i) ITR 序列和 (ii) Rep 蛋白識(shí)別序列基序，這一發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。雖然之前的 AAV 基因治療載體僅限于 AAV-2 衣殼，但使用來(lái)自更遠(yuǎn)親的分離血清型（包括 AAV-4 和 AAV-5）的衣殼創(chuàng)建載體的能力建立了不同 AAV 分離株的“可載體性”。這些結(jié)果是 AAV 載體學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性發(fā)現(xiàn)。
在非臨床研究中，AAV-5 載體已證明可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)各種組織類(lèi)型，包括肺、肝、肌肉和腦組織。目前，兩種利用AAV-5的基因治療產(chǎn)品已獲得監(jiān)管部門(mén)的批準(zhǔn)，分別是uniQure針對(duì)B型血友病開(kāi)發(fā)的Hemgenix?（FDA批準(zhǔn)）和BioMarin針對(duì)A型血友病開(kāi)發(fā)的Roctavian?（EMA批準(zhǔn)）。其它基于 AAV-5 的基因療法也正在開(kāi)發(fā)中，用于治療其它遺傳疾病，包括肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、血友病和遺傳性視網(wǎng)膜疾病。此外，研究正在進(jìn)行中，以探索 AAV-5 載體向大腦遞送治療基因的潛力，目標(biāo)是治療帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
盡管rAAV在基因治療中很受歡迎，但對(duì)人類(lèi)AAV感染的自然生物學(xué)和流行病學(xué)的了解仍然非常有限。然而，基于血清學(xué)和基因測(cè)序的研究提供了明確的證據(jù)，表明靈長(zhǎng)類(lèi)依賴(lài)細(xì)小病毒1在人群中自然傳播。相比之下，依賴(lài)細(xì)小病毒哺乳動(dòng)物1（即AAV-5）在人類(lèi)中自然循環(huán)的證據(jù)主要基于血清學(xué)數(shù)據(jù)?？傮w而言，AAV-5 特異性抗體的流行率似乎低于其它 AAV 血清型，并且不同人群之間似乎存在差異。
圖1. 腺相關(guān)病毒的進(jìn)化關(guān)系。自舉系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（1000 個(gè)重復(fù)）顯示了腺相關(guān)病毒 (AAV) 分離株之間重建的進(jìn)化關(guān)系。該樹(shù)是根據(jù)跨越rep基因的393個(gè)核苷酸的比對(duì)構(gòu)建的，使用RAxML中實(shí)現(xiàn)的最大似然和核苷酸替換的一般時(shí)間可逆模型。星號(hào)表示引導(dǎo)程序支持 >70% 的節(jié)點(diǎn)。比例尺表示每個(gè)位點(diǎn)替換的進(jìn)化距離。動(dòng)物剪影表明宿主物種關(guān)聯(lián)。大多數(shù) AAV 血清型，包括 AAV-1 至 AAV-4、AAV-6 至 AAV-12，似乎代表了靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物特異性的多樣性，并且是單一物種“靈長(zhǎng)類(lèi)依賴(lài)細(xì)小病毒 1”的成員（由粉紅色括號(hào)表示）。盡管這些病毒與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物有關(guān)，但它們與個(gè)別靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的關(guān)系尚不確定，因此輪廓顯示在括號(hào)右側(cè)。然而，它們與猿猴靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的長(zhǎng)期關(guān)聯(lián)通過(guò)在猿猴基因組中插入約 2000 萬(wàn)年前的內(nèi)源細(xì)小病毒元件 (EPV) (EPV-Dependo.13) 得到證明，該元件在以下物種的多樣性中穩(wěn)健分組：靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物依賴(lài)細(xì)小病毒1。與從靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物樣本中獲得的所有其它 AAV 不同，AAV-5（以紅色表示）在有蹄類(lèi)動(dòng)物病毒的多樣性中表現(xiàn)強(qiáng)勁，并且與山羊 AAV 關(guān)系尤其密切。
AAV-5 的非靈長(zhǎng)類(lèi)起源
已發(fā)現(xiàn)許多非靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物物種是依賴(lài)細(xì)小病毒的宿主，包括蝙蝠、嚙齒動(dòng)物、食肉動(dòng)物和有蹄類(lèi)動(dòng)物。雖然其中一些病毒，例如牛腺相關(guān)病毒 (BAAV)，早在 20 世紀(jì) 70 年代就被發(fā)現(xiàn)了，但它們的基因組序列直到許多年后才被表征。然而，當(dāng)最終獲得有蹄類(lèi) AAV（包括 BAAV 和“山羊腺相關(guān)病毒”（CAAV））的基因組序列時(shí)，意外地發(fā)現(xiàn)這些病毒物種與 AAV-5 具有密切的進(jìn)化關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)表明跨物種轉(zhuǎn)移可能已經(jīng)發(fā)生。
直到最近，由于缺乏有關(guān) AAV 自然生態(tài)和多樣性的信息，因此很難從 AAV 系統(tǒng)發(fā)育中得出有關(guān)跨物種轉(zhuǎn)移方向性的可靠結(jié)論。然而，自 2000 年代中期以來(lái)，病毒基因組測(cè)序的巨大進(jìn)步極大地?cái)U(kuò)展了我們對(duì)病毒多樣性的理解，從而可以更可靠地推斷宿主與細(xì)小病毒的關(guān)系。目前的數(shù)據(jù)表明，AAV 很少在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的哺乳動(dòng)物群體之間傳播。因此，對(duì) AAV 分離株之間觀察到的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最簡(jiǎn)潔的解釋是 AAV-5 是否起源于有蹄類(lèi)動(dòng)物。
通過(guò)宿主物種基因組測(cè)序揭示了有關(guān)宿主與細(xì)小病毒關(guān)系的更多信息。這表明源自細(xì)小病毒（包括 AAV）的 DNA 序列廣泛存在于動(dòng)物物種的種系基因組中。這些序列被稱(chēng)為“內(nèi)源性細(xì)小病毒元件”（EPV），通常已有數(shù)百萬(wàn)年的歷史，很可能起源于源自古代細(xì)小病毒的 DNA 被整合到祖先宿主物種的種系中時(shí)。 EPV 為細(xì)小病毒與宿主物種之間的長(zhǎng)期共同進(jìn)化關(guān)系提供了獨(dú)特的見(jiàn)解。 EPV 和當(dāng)代細(xì)小病毒的系統(tǒng)發(fā)展表明，在 獼猴靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一些 EPV 來(lái)自約 1600-2300 萬(wàn)年前傳播的當(dāng)代靈長(zhǎng)類(lèi) AAV 的古代祖先（圖 1）。這些發(fā)現(xiàn)表明，AAV 譜系與宿主群體具有穩(wěn)定、長(zhǎng)期的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步支持 AAV-5 起源于有蹄類(lèi)動(dòng)物的觀點(diǎn)。
理論上，AAV-5 有蹄類(lèi)動(dòng)物向人類(lèi)傳播至少有兩種可能發(fā)生的情況。一種常見(jiàn)的情況是生物制藥產(chǎn)品無(wú)意中受到污染，這可能會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)感染。 AAV 是眾所周知的細(xì)胞和病毒培養(yǎng)系統(tǒng)污染物，并且存在多種可能的污染源。其中，來(lái)自有蹄類(lèi)動(dòng)物的生物材料，例如胎牛血清（FBS），是最有可能的來(lái)源。數(shù)十年來(lái)，F(xiàn)BS 已廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，并被認(rèn)為是外源因子的潛在來(lái)源。過(guò)去，胎牛血清處理依賴(lài)于除菌過(guò)濾，這不能消除病毒顆粒。然而，如果 FBS 受到污染，則可能會(huì)在多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施中檢測(cè)到 AAV5 的存在。
另外，由于 AAV5 是從生殖器軟骨瘤中分離出來(lái)的，因此它在人類(lèi)中的存在可以通過(guò)性接觸來(lái)解釋。由于人類(lèi)與有蹄類(lèi)動(dòng)物密切接觸已有數(shù)千年，而且 AAV-5 在人群中的血清流行率相對(duì)較低，因此跨物種傳播可能只會(huì)在異常情況下發(fā)生。與流行的傳說(shuō)相反，通過(guò)動(dòng)物戀行為發(fā)生病毒人畜共患傳播的記錄實(shí)例很少。然而，在這種特殊情況下，可以合理地認(rèn)為此類(lèi)行為發(fā)揮了作用。獲得并檢查與獲得 AAV-5 的軟骨瘤相關(guān)的乳頭瘤病毒基因組序列可能很有趣，以確定這些序列是否屬于人類(lèi)中常見(jiàn)的病毒基因型，而不是有蹄類(lèi)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的病毒基因型。
在圖2中，我們提出了 AAV-5 出現(xiàn)和流行病學(xué)的四種替代模型，每種模型都是根據(jù) (i) 跨物種傳播頻率和 (ii) 人際傳播程度的差異來(lái)定義的。如果 AAV-5 血清學(xué)準(zhǔn)確反映了 AAV-5 感染的血清轉(zhuǎn)化，那么人群中的流行率可能反映了人與人之間的傳播（或藥物的大規(guī)模污染）。如果血清陽(yáng)性是由交叉反應(yīng)抗體（即靈長(zhǎng)類(lèi) AAV 和 AAV-5 之間的共同表位）引起的，那么這兩種 AAV 的血清陽(yáng)性率預(yù)計(jì)將高度相關(guān)。也許開(kāi)發(fā)提高衣殼特異性和減少交叉反應(yīng)性的檢測(cè)方法將有助于解決血清陽(yáng)性率的不確定性。盡管 AAV-2 和 AAV-5 的主要外殼蛋白 (VP3) 僅具有約 60% 的同一性，但基于線性和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析的表位預(yù)測(cè)表明存在幾個(gè)常見(jiàn)表位。接觸 AAV-2 或其它靈長(zhǎng)類(lèi) AAV 可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)抗體，這意味著衣殼結(jié)合抗體無(wú)法確定 AAV-5 血清陽(yáng)性率。
圖2 人類(lèi)AAV-5出現(xiàn)模型。顯示 AAV-5 出現(xiàn)的替代模型的矩陣。這些模型是根據(jù)以下方面的差異來(lái)定義的：(i) 跨物種傳播的頻率，以及 (ii) 人際傳播的程度。在模型 (i) 中，跨物種傳播是一種罕見(jiàn)事件，不會(huì)繼續(xù)傳播 - 在這種情況下，報(bào)告的 AAV-5 血清陽(yáng)性即使不是人為的，也必然通過(guò)人類(lèi)接觸受污染的生物藥品而發(fā)生。在模型 (ii) 中，AAV-5 的人際傳播確實(shí)經(jīng)常發(fā)生，并且所有 AAV-5 分離株均源自少數(shù)跨物種傳播事件，可能不超過(guò)一次。該模型可以在不使用受污染的生物藥品的情況下解釋人類(lèi)中的 AAV-5 血清陽(yáng)性，但這意味著它應(yīng)該有一個(gè)明確的分布，在暴露人群中患病率更高。在模型（iii）中，跨物種傳播發(fā)生得更頻繁，但人際傳播則不然。在此模型中，AAV 5 血清陽(yáng)性預(yù)計(jì)僅發(fā)生在直接從有蹄類(lèi)動(dòng)物或通過(guò)受污染的生物藥品感染病毒的個(gè)體中。在模型（iv）中，跨物種傳播發(fā)生得更頻繁，其中許多事件導(dǎo)致人與人之間的傳播。這可以解釋在不涉及受污染的生物藥品的情況下，人群中 AAV-5 血清陽(yáng)性率高的原因，但這違背了進(jìn)化論的預(yù)期，因?yàn)樽罱ㄟ^(guò)人畜共患病獲得的病毒被認(rèn)為通常在受體宿主物種中具有較低的傳播性。
總結(jié)
如果如血清學(xué)研究表明的那樣，AAV-5 感染確實(shí)在人群中廣泛存在，那么這就提出了幾個(gè)重要問(wèn)題。首先，人類(lèi)感染 AAV-5 是最近才出現(xiàn)的，還是前幾年沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)？考慮到人類(lèi)和家養(yǎng)有蹄類(lèi)動(dòng)物之間長(zhǎng)期存在的相互作用，跨物種傳播可能會(huì)更早發(fā)生。其次，如果確實(shí)發(fā)生人際傳播，AAV-5是否適應(yīng)了人類(lèi)宿主？此外，關(guān)于 AAV-5 感染的自然途徑和體內(nèi)目標(biāo)組織也存在問(wèn)題。對(duì)自然循環(huán)的 AAV-5 多樣性進(jìn)行小規(guī)模、基于序列的探索可以闡明其中許多問(wèn)題，并提供回答其它問(wèn)題的途徑。
原文：R.J.Gifford, R.M.Kotin, Unraveling the origins of human adeno-associated virus 5. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(4), 265–273.
