疫苗是預防和控制傳染病最經濟、有效的手段，疫苗接種是通過誘導機體產生保護性免疫應答來預防和控制人類和動物疾病的常規方法。疫苗技術已經從以巴斯德原則的病原體“分離、滅活和注射”發展到基于基因工程、免疫學、結構生物學、反向疫苗學和系統生物學融合的現代疫苗技術，正在向著癌癥、自身免疫病和其他慢性疾病等領域拓展。面對當今重大、復雜、突發、高變病原體，傳統疫苗學方法難以滿足需求，而且還有部分重大感染性疾病的疫苗品種，如針對HIV、結核桿菌、瘧原蟲和其他廣泛傳播的病原體的疫苗尚未研發成功，新型疫苗技術是應對未來全球健康挑戰的有利武器。本文主要梳理了當前各類熱點技術疫苗生產工藝，僅供學習參考。重組蛋白疫苗工藝是一種新型的疫苗制備技術，它利用基因工程技術將病原體的特定蛋白基因克隆到表達載體中，通過大規模的細胞培養和純化技術制備出高純度的蛋白質疫苗。相比傳統的滅活疫苗和活疫苗，重組蛋白疫苗具有安全性高、穩定性好、易于生產等優點，已經成為當前疫繭研究的熱點之一。1.基因克隆:將病原體的特定蛋白基因克隆到表達載體中，構建重組表達載體。2.細胞培養:將重組表達載體轉染到宿主細胞中，通過細胞培養技術大規模生產重組蛋白。3.蛋白純化:通過離心、層析、電泳等技術將重組蛋白從細胞培養液中純化出來，得到高純度的蛋白質疫苗。4.疫苗制備:將純化后的重組蛋白與適當的佐劑混合，制備成疫苗。重組蛋白疫苗的制備過程相對復雜，需要高水平的技術和設備支持。但是，相比傳統的滅活疫苗和活疫苗，重組蛋白疫苗具有更好的安全性和穩定性，能夠有效預防多種傳染病，如乙肝、流感、艾滋病等。VLP疫苗生產工藝是- -種新型的疫苗生產技術，它是利用基因工程技術將病毒的外殼蛋白表達出來，形成類似于病毒的顆粒，這些顆粒被稱為病毒樣顆粒(VLP)，它們具有與真正的病毒相同的外形和結構，但是不含有病毒的核酸，因此不會引起疾病。VLP疫苗具有很高的安全性和兔疫原性，已經被廣泛應甩于預防多種傳染病，如乙型肝炎、人乳頭瘤病毒感染等。1.基因克隆:首先需要將病毒的外殼蛋白基因克隆到表達載體中，這個過程需要利用PCR技術擴增目標基因，并將其插入到表達載體中。2.細胞培養:將表達載體轉染到宿主細胞中，使其表達外殼蛋白基因，產生VLP顆粒。常用的宿主細胞包括酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。3.純化和提取:將細胞培養液進行離心、過濾等操作，將VLP顆粒從細胞碎片、蛋白質等雜質中分離出來。常用的純化方法包括超速離心、柱層析、電泳等。4.疫苗制備:將純化后的VLP顆粒進行滅活、加工等處理，制備成疫苗。常用的加工方法包括凍干、混懸液等。如果表達系統表達的是單體或多聚體蛋白，使用物理或自動組裝成與天然病毒相似的空心顆粒作為疫苗，這被稱為類病毒顆粒（VLP），如預防人乳頭瘤病毒的HPV疫苗。目前通常使用酵母表達系統生產VLP疫苗，因為疫苗蛋白為胞內表達，完成發酵收集菌體后，需要將酵母細胞破碎，使用澄清過濾去除細胞碎片，經過Mustang膜層析捕獲目標蛋白，寬泛流速范圍，尖銳洗脫峰優勢更加明顯。進一步精純后，超濾換液，進入制劑灌裝環節。隨著疫苗研制技術發展，上述提到的傳統疫苗中的細菌多糖疫苗，為了提高其免疫效應，使用化學方法將蛋白成份與多糖結合，制備出多糖結合疫苗，可增加嬰幼兒對細菌多糖的免疫效應。其工藝主要流程是上游經過細菌發酵，收集菌體，加入滅活劑進行脫毒處理后，使用深層過濾方法以保證過程的生物符合。使用超濾系統濃縮降低收獲液體積并去除小分子蛋白，經過澄清過濾攔截大分子及有形雜質后，重復經過超濾和澄清過濾，完成多糖的制備。此時，可以進行多糖疫苗的制劑灌裝。結合疫苗則進入蛋白結合步驟，此步驟主要使用化學方法將蛋白與多糖結合，過程中除了結合的目標產物外，還會產生游離多糖和蛋白，一般采用超濾和層析方法去除。在制劑灌裝階段使用一次性配液灌裝系統，可以提高批件切換效率，避免不同血清型原液的交叉污染。多糖結合疫苗由于是通過化學方法將蛋白與多糖結合，因此需要對生產/加工后的大分子完整性進行監測。貝克曼庫爾特的分析型超速離心技術（AUC）現在被認為是評估分子完整性和聚集體的重要技術，可以對蛋白質和細菌多糖組成的的大型糖綴合物分子量分布進行檢測，從而分析多糖結合疫苗的完整性情況。病毒載體疫苗是一種利用病毒疫苗減毒株或非復制型病毒作為載體，將抗原基因的編碼有效地傳遞到宿主細胞核并引發免疫應答的疫苗。目前已有多種病毒，如腺病毒、慢病毒、水皰性口炎病毒、皰疹病毒、麻疹病毒和重組牛痘病毒安卡拉株等作為載體用于疫苗的研發。病毒基因組可以表達任何特定的抗原，并可穩定接受大基因片段的插入，抗原可在宿主中準確的合成、修飾以及靶向特異細胞，使得病毒載體技術可用于多種疫苗開發。例如，康希諾生物的腺病毒載體新冠疫苗（Ad5-nCoV）是把新冠病毒S蛋白的基因構建到腺病毒基因組。外殼仍然是腺病毒的正常外殼蛋白，但里面的基因卻含有編碼新冠病毒S蛋白的基因。因此，腺病毒侵染宿主細胞的時候，把編碼新冠病毒S蛋白的基因都釋放到宿主細胞，在細胞質中合成S蛋白，由S蛋白激發一系列的免疫反應。
滅活疫苗是對病毒或細菌進行培養后通過物理或化學方法處理將其滅活從而獲得無感染活性的一類疫苗。相較于減毒疫苗和基因工程疫苗，滅活疫苗具有研發周期短、制備工藝相對成熟、無感染毒力和安全性高等優點。但一般需要多次接種才能產生保護性免疫[2]，通常誘導產生體液免疫應答，細胞免疫普遍較弱。目前已在國內上市的滅活疫苗包括脊灰滅活疫苗、乙腦滅活疫苗、百日咳-白喉-破傷風（百白破）疫苗、流感疫苗和人用狂犬病疫苗等，以及國藥中生和科興生物的新冠滅活疫苗。滅活疫苗平臺相對成熟，安全性高，應對新發病原體響應速度快。它的生產工藝流程包括以下幾個流程:1.病原體的培養：滅活疫苗的制作需要先培養病原體。病原體可以是病毒、細菌或其他微生物。在實驗室中，病原體會被培養在適當的培養基上，以便它們能夠生長和繁殖。2.病原體的滅活：一旦病原體被培養出來，就需要將其滅活。滅活的方法有多種，包括化學滅活、熱滅活和輻射滅活等。這些方法都能夠殺死病原體，但不會破壞其抗原性，從而使其仍能夠激發人體免疫系統產生免疫反應。3.病原體的提取和純化：滅活的病原體需要被提取和純化，以便制成疫苗。這個過程通常涉及到多個步驟，包括離心、過濾、沉淀和洗滌等。這些步驟可以去除病原體中的雜質，從而提高疫苗的純度和效力。4.疫苗的配制和包裝：一旦病原體被提取和純化，就需要將其配制成疫苗。這個過程通常涉及到將病原體與適當的輔料混合在一起，以便制成疫苗。這些輔料可以包括防腐劑、穩定劑和緩沖劑等。一.旦疫苗被配制好，就需要將其包裝在適當的容器中，以便運輸和儲存。5.疫苗的質量控制：滅活疫苗需要經過質量控制，以確保其安全和有效。這個過程通常涉及到多個步驟，包括疫苗的理化性質測試、微生物學測試和動物實驗等。只有通過了這些測試，疫苗才能夠被批準用于人類接種。滅活疫苗的生產工藝流程是一個復 雜的過程，需要經過多個步驟才能夠制成。這些步驟包括病原體的培養、滅活、提取和純化、疫苗的配制和包裝以及疫苗的質量控制等。只有通過這些步驟，才能夠制成安全有效的滅活疫苗，用于預防疾病。DNA疫苗是將編碼抗原蛋白的真核表達盒插入到細菌質粒中，再由高效的真核啟動子驅動抗原蛋白的表達。DNA疫苗可以誘導機體產生體液免疫和細胞免疫、免疫效果持久性強、制備簡單、易大規模生產，但也存在免疫原性弱、質粒DNA遞送效率低和表達效率低等不足，以及外源基因整合到宿主基因組而導致的突變和生成腫瘤的風險。目前進入臨床試驗的DNA疫苗有中東呼吸綜合征疫苗、寨卡病毒疫苗、HIV疫苗、流感疫苗、EBOV疫苗、宮頸癌疫苗GX-188E、B細胞淋巴瘤疫苗、登革熱疫苗TVDV等，以及11個COVID-19疫苗，其中INO4800編碼SARA-CoV-2全長S蛋白，Ⅰ期臨床研究數據顯示該疫苗無嚴重不良反應，能刺激產生體液免疫和細胞免疫。DNA疫苗受限于較弱的免疫應答和較大的免疫劑量，以及如何有效遞送，期待未來改進。1．質粒庫和三級種子庫的建立:天然質粒存在缺陷，不能直接應用于實際基因工程。構建良好的質粒庫和種子庫，可以高效生產特定需求的質粒DNA疫苗。2．工程菌的發酵培養DNA:疫苗工程菌的發酵培養實際上是DNA疫苗生產工藝的重要步驟，培養菌的好壞會在很大程度上決定質粒產量。所以需要獲得質量較高的菌群，優化培養方案。3．裂解菌體: DNA疫苗的生產，需要使用裂解工藝，這就需要進行裂解劑的選擇、裂解工藝的優化研究，并進行工藝驗證。在大規模生產中，不能采用實驗室常用的超聲破碎和高壓勻漿以及堿裂解法等方法。我們需要控制溫和穩定的反應體系,控制裂解時間在5分鐘以內(時間也不宜過短)，裂解pH值范圍為12.0-12.5, 攪拌條件需溫和且可以充分均勻。4．質粒DNA的回收：裂解處理完成后，需要對所得液體進行澄清處理。合適的澄清操作可以初步去除細胞碎片、全細胞、膠質及其他一些較大的聚集物，為下游后續的工藝減少壓力。在一-定程度上，澄清還可以降低一些不溶性雜質、宿主細胞蛋白及核酸的含量。一般使用離心、過濾工藝實現該流程。有時可分為多個步驟,如先進行初步澄清除去較大雜質顆粒,再進行澄清除去膠質和較小顆粒。5．質粒初步純化:進行裂解完的溶液通常還含有細胞蛋白(雜蛋白)、培養中引入的雜質等物質。如果疫苗中含雜質量過多，則會引起過敏反應或其他不良反應。因此，疫苗必須進行純化，去除雜質。初步純化可以濾去大部分雜質，降低后續工藝的壓力。我們應通過對雜質去除率、DNA回收率等的研究選擇不同截留分子量的超濾膜、確定濃縮倍數。組件的選擇需要根據當次的生產所需(包括需要了解過程流體和CIP (溶出物、吸附、溶脹、脫落，通過VI級) 的化學和機械穩固性、進料通道填塞、殘存/工作體積、傳質效率等一系列的參數)，按照過濾組件供應商所提供的數據選擇，并且需要進行小規模試驗后(組件需要能可靠線性放大)，確定最終的生產工藝的所需組件規格與設定。-般性的工藝流程可如下(注:各操作條件可具有靈活性,實際根據產品規格要與生產工藝相適應，確保性能優良)。6．質粒高度純化:純化時，需要使電導率、紫外吸收、鹽濃度、pH值均達到平衡，讓條件溫和穩定，一般凝 膠過濾層析配合其他層析方法聯合使用達到最佳效果。柱層析和/或密度梯度離心為去除雜質的有效步驟，應優化層析條件，如層析柱類型、上樣量、洗脫液條件等工藝參數。純化工藝確定后，還要對其進行驗證。通過對各純化步驟對細胞基質相關雜質、工藝相關雜質(如有機溶劑、核酸內切酶、滅活劑、裂解劑等)的去除效果以及對有效成分的分離純化效果的驗證，來評估純化工藝的合理性。同時，還要關注純化過程中污染的控制，進行中間產物(如超濾液、層析洗脫液等)及微生物限度的檢測，并根據多批次的生產檢定結果建立限度標準。7．濃縮、配制、除菌過濾以及分裝等：膜組件(超濾濃縮) :中空纖維膜組件，平板膜包等都可以滿足基本濃縮工藝要求。完成濃縮后，再進行除菌過濾，確保產品的無污染，并根據要求進行配置分裝。制備工藝是制備成功的關鍵因素，但是質粒庫、種子庫、工程菌發酵液、疫苗原液和成品的樣品質量檢測等質量控制體系與保證體系也是在DNA疫苗制備的非常關鍵的因素。以及對產品的毒性檢測也是值得深入研究的。mRNA疫苗的研發過程包括選擇目標病原體的特異性抗原蛋白，對該蛋白基因進行測序、合成并克隆到DNA模板質粒中，在體外轉錄成mRNA，然后接種到受試者體內。目前，mRNA疫苗主要包括兩類，傳統的非復制型mRNA和自我擴增型mRNA。相比于傳統疫苗，mRNA疫苗具有與活病毒類似的免疫應答機制、無感染或整合到宿主基因組的風險、更穩定并能夠高效表達抗原蛋白、簡單快速的化學合成制備更容易低成本和大規模生產。目前研究較多的是自我擴增型RNA（SAM），因為其含有一個α病毒基因組，有完整的編碼RNA復制機制的相關基因。以新冠病毒（SARS-CoV-2）mRNA疫苗為例，其生產工藝流程大致如下：1．DNA原液制備：首先需要設計與構建含有S蛋白基因序列的載體，然后通過大腸桿菌放大培養，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質粒。2．mRNA原液的制備：獲取的攜帶S蛋白基因序列的質粒線性化{（噬菌體啟動子（T7）-5 UTR-開放閱讀框（ORF）-3 個非翻譯區（UTR）-polyA}通過體外轉錄（IVT）將前mRNA5'端加帽子。后續需要經過一系列的純化，除菌等過程。除去酶、游離核苷酸、殘留 DNA 和外源 RNA 片段，dsRNA, 及反應體系中的免疫原性雜質。滿足 GMP 生產的質量需求。Moderna的mRNA還需要把尿苷替換成假尿苷，以降低免疫原性。3．利用脂質微粒進行包封：制備遞送系統，例如基于聚合物或脂質的納米顆粒(LNP)，然后使用不同制造商特有的方法將純化的mRNA封裝在其中。由此產生的mRNA/遞送納米顆粒組件經過濃縮、緩沖液交換和無菌過濾。然后最終評估并按此順序包裝成袋/瓶作為原料藥。原料藥通常在最終形成（盡管不適用于某些工藝）最終藥物產品填充之前冷凍儲存，在某些情況下隨后還需要進行凍干。
